簡要描述：殘留DNA提qu試劑盒遵照中國藥典記載的碘化na法，適用于疫苗和治療用生物制品所含宿主細胞殘余DNA的提取。殘留DNA提qu試劑盒可以提取樣品中含有的極微量的DNA，回收率較高。DNA的提取操作時間為60-90 min。提取的DNA可以通過qPCR進行定量。
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生物制藥殘留DNA提qu試劑盒（碘化na法）
殘留DNA提qu試劑盒遵照中國藥典記載的碘化na法，適用于疫苗和治療用生物制品所含宿主細胞殘余DNA的提取。
殘留DNA提qu試劑盒可以提取樣品中含有的極微量的DNA，回收率較高。DNA的提取操作時間為60-90 min。提取的DNA可以通過qPCR進行定量。
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◆特點
● 高回收率回收微量DNA（100-1,000 fg）
● 無需更換試管（全程僅使用1根試管）
● 整個提取過程僅需60-90 min
● 提供高濃度蛋白樣品的前處理實驗方案
● 回收后的DNA可通過qPCR、Threshold Assay(Molecular Devices)進行定量
● 采用碘化na法
◆原理
1. 使樣品中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)溶于碘化na和月桂酰肌氨酸鈉；
2. 異丙醇與糖原選擇性地共沉淀DNA。
◆標準步驟
◆應(yīng)用實例
DNA spiking test（加標回收實驗）
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DNA Extractor™ Kit可以高產(chǎn)量提取殘留DNA，甚至少量殘留DNA。
◆抗體藥物適用性研究
從高蛋白溶液中提取DNA
使用不同濃度的IgG溶液檢測CHO來源DNA的加標回收率。
方法
1） 向不同濃度的IgG溶液(10-100 mg/mL)中添加2 pg/mL CHO來源DNA。
2） 按照本產(chǎn)品說明書記載的實驗方案提取DNA。
● 提取實驗方案：Protocol#2
● 樣品前處理：蛋白濃度超過2 mg/mL時實施的前處理方案（Proteinase K處理）
3） 通過qPCR法計算提取的CHO來源DNA的回收率。
結(jié)果
不同蛋白濃度溶液的Cq值
Sample | Input | 蛋白濃度 (mg/mL) | |||||
10 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | ||
Cq | 31.596 | 31.566 | 31.351 | 31.726 | 31.502 | 31.282 | 31.658 |
31.599 | 31.608 | 31.774 | 31.787 | － | 31.485 | 31.66 | |
31.338 | 31.861 | 31.5 | 31.85 | 31.56 | 31.369 | － | |
Average Cq | 31.511 | 31.678 | 31.542 | 31.788 | 31.531 | 31.379 | 31.659 |
Difference of Cq | 0 | -0.167 | 0.136 | -0.246 | 0.257 | 0.152 | -0.28 |
Power | 1 | 0.891 | 1.099 | 0.843 | 1.195 | 1.111 | 0.824 |
Recovery Rate (%) | 100 | 89.1 | 109.9 | 84.3 | 119.5 | 111.1 | 82.4 |
不同蛋白濃度溶液的CHO來源DNA回收率
結(jié)果顯示，即使蛋白濃度高達100 mg/mL，也能高回收率提取CHO來源DNA。
從抗體藥物模擬溶液中提取 DNA
檢測抗體藥物常用的Buffer及添加劑制備的IgG溶液中的 CHO來源DNA的加標回收率。
方法
1） 向抗體藥物中常用的Buffer組成（表1.①-⑥）及添加劑溶液中添加20 mg/mL的IgG蛋白，制備不同的抗體藥物模擬溶液。向不同溶液中添加
1） 20 pg/mL CHO來源DNA。
2） 根據(jù)本產(chǎn)品說明書記載的實驗方案提取DNA。
● 提取實驗方案：Protocol#2
● 樣品前處理：蛋白濃度超過2 mg/mL時實施的前處理方案（Proteinase K處理）
3） 通過qPCR法計算提取的CHO來源DNA的回收率。
表1 Buffer組成
No. | Buffer組成 |
① | 10 mM PB pH 6.0, 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA |
② | 10 mM PB pH 7.4, 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA |
③ | 50 mM NaOAc pH 5.2, 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA |
④ | 10 mM PB pH 6.0, 2 mM EDTA |
⑤ | 10 mM PB pH 7.4, 2 mM EDTA |
⑥ | 50 mM NaOAc pH 5.2, 2 mM EDTA |
表2 添加劑溶液
Buffer: 10 mM PB pH 6.0, 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA
No. | 添加劑（濃度） |
① | Sucrose (10 w/v%) |
② | Trehalose Dihydrate (10 w/v%) |
③ | D(-)-Mannitol (10 w/v%) |
④ | D(-)-Sorbitol (10 w/v%) |
⑤ | D(+)-Maltose Monohydrate (10 w/v%) |
⑥ | L(+)-Arginine Hydrochloride (1 w/v%) |
⑦ | L‐Histidine (1 w/v%) |
⑧ | Glycine (1 w/v%) |
⑨ | Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate (Tween80) (0.5 v/v%) |
⑩ | Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate (Tween20) (0.5 v/v%) |
結(jié)果
不同Buffer的Cq值
| Sample | Input | Buffer | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| Cq | 31.473 | 31.693 | 31.544 | 31.218 | 31.058 | 31.595 | 31.181 |
| 31.364 | 31.196 | 30.973 | 31.568 | 31.085 | 31.343 | 31.112 | |
| 31.045 | 31.53 | 31.787 | 31.315 | 30.942 | 31.452 | 31.558 | |
| Average Cq | 31.294 | 31.473 | 31.435 | 31.367 | 31.028 | 31.463 | 31.284 |
| Difference of Cq | 0 | -0.179 | -0.141 | -0.073 | 0.266 | -0.169 | 0.01 |
| Power | 1 | 0.883 | 0.907 | 0.951 | 1.203 | 0.89 | 1.007 |
| Recovery Rate (%) | 100 | 88.3 | 90.7 | 95.1 | 120.3 | 89 | 100.7 |
不同Buffer的CHO來源DNA回收率
不同添加劑溶液的Cq值
Sample | Input | 添加劑溶液 | |||||||||
① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ | ⑨ | ⑩ | ||
Cq | 31.473 | 31.826 | 31.327 | 30.907 | 31.143 | 31.071 | 31.525 | － | 31.525 | 31.013 | 31.086 |
31.364 | 31.194 | 30.991 | 31.759 | 31.103 | 31.279 | 31.068 | 31.442 | 31.203 | 31.34 | 30.87 | |
31.045 | 30.703 | － | 31.009 | － | 30.978 | 31.225 | 31.479 | 30.757 | 31.02 | 31.02 | |
Average Cq | 31.294 | 31.241 | 31.159 | 31.225 | 31.123 | 31.109 | 31.273 | 31.461 | 31.162 | 31.124 | 30.992 |
Difference of Cq | 0 | 0.053 | 0.135 | 0.069 | 0.171 | 0.185 | 0.021 | -0.167 | 0.132 | 0.17 | 0.302 |
Power | 1 | 1.037 | 1.098 | 1.049 | 1.126 | 1.137 | 1.015 | 0.891 | 1.096 | 1.125 | 1.233 |
Recovery Rate (%) | 100 | 103.7 | 109.8 | 104.9 | 112.6 | 113.7 | 101.5 | 89.1 | 109.6 | 112.5 | 123.3 |
不同添加物溶液的CHO來源DNA回收率
結(jié)果顯示，即使含有不同Buffer組成和添加劑的IgG溶液也能高回收率提取CHO來源DNA。
◆試劑盒構(gòu)成
產(chǎn)品編號 | 內(nèi)容物 | 內(nèi)容量 |
299-81111 | 碘化na溶液, CP | 26 mL |
296-81121 | 月桂酰肌氨酸鈉, CP | 1.2 mL |
293-81131 | 洗凈液A, CP | 42 mL |
290-81141 | 洗凈液B, CP | 40 mL×2 |
297-81151 | 糖原溶液, CP | 0.1 mL |
備注：每種成分不單獨出售
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| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 292-81101 | 殘留DNA提qu試劑盒（碘化na法） DNA Extractor™ Kit for Residual DNA, CP Method (Sodium Iodide Method) | 50 tests | - | - |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 290-85301 | QCdetect(TM) Residual DNA Detection Kit for E. coli QCdetect™ 殘留DNA檢測試劑盒，大腸桿菌用 | 100 tests | - | - |
| 294-85201 | QCdetect(TM) Residual DNA Detection Kit for CHO cells QCdetect™ 殘留DNA檢測試劑盒，CHO細胞用 | 100 tests | - | - |
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