◆Memo

關(guān)于NO研究中Photo-controllable NO donor的意義及問題點(diǎn)

雖然一氧化氮是分子量?jī)H有30的氣體分子，但是在生物體內(nèi)作為信號(hào)傳輸物質(zhì)而發(fā)揮作用，因此闡明其生理意義是一項(xiàng)重要的課題。下文闡述了一些與NO研究相關(guān)的生理現(xiàn)象。

●　血管舒張（vasodilation）

●　神經(jīng)傳輸（neurotransmission）

●　血小板黏附（platelet adhesion）

●　炎癥反應(yīng)（inflammation）

NO的氣體分子是通過生物體內(nèi)的NO合成酶產(chǎn)生，但在生理?xiàng)l件下極其不穩(wěn)定，半衰期約為幾秒左右。因此，NO被認(rèn)為是在生物體內(nèi)產(chǎn)生后，僅在非常狹小的范圍（<100 μm）內(nèi)起作用的局部信號(hào)傳輸物質(zhì)，因此，期待能夠闡明NO作為媒介參與的局部信號(hào)傳輸?shù)囊饬x。然而，由于NO是不穩(wěn)定的氣體分子，難以用于實(shí)驗(yàn)中，于是NO donor便被用于驗(yàn)證NO生理效果。

NO donor是在水溶液中分解，并緩慢釋放NO的化合物群的總稱。不同NO釋放效率以及半衰期各異的化合物被開發(fā)成各種產(chǎn)品。然而，使用以前的NO釋放劑，會(huì)使實(shí)驗(yàn)溶液全部均一地釋放出NO，導(dǎo)致很難觀察到原來的NO作用于局部的瞬時(shí)效果。為了解決該問題，近年來已開發(fā)出幾種光反應(yīng)性的NO donor如“Photo-controllable NO donor"，1） 需要UV光的試劑類，或2） 主要使用金屬絡(luò)合物的試劑類，但無論哪種都有難以適用于活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)（參照表格）。

名古屋市立大學(xué)的中川秀彥教授等人克服了至今的問題，成功開發(fā)出不含金屬絡(luò)合物，毒性低且能在時(shí)間空間上控制NO釋放，并通過可視光控制的Photo-controllable NO donor——NO-Rosa5（Controllable NOdonor）。使用本產(chǎn)品，可以在任意時(shí)間以及任意局部控制NO釋放，作為研究NO的新工具而備受期待。

◆參考文獻(xiàn)

◆原理

本試劑將Rosamine色素骨架用作光吸收天線，在吸收黃綠色光（530~590 nm）時(shí)，誘導(dǎo)光致電子轉(zhuǎn)移(PeT: Photoinduced electron Transfer)，釋放出NO。

◆特點(diǎn)

●　通過黃綠色光（530~590 nm；最大吸收λmax～560 nm）引發(fā)NO釋放。

●　非光照射時(shí)，NO釋放量被抑制在極其微小的程度^*1 。

●　推薦使用濃度10 μM，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性。

●　已驗(yàn)證了在培養(yǎng)細(xì)胞系，ex vivo主動(dòng)脈血管舒張實(shí)驗(yàn)中的生物活性。

●　已證實(shí)顯微鏡的543 nm射線（He- Ne射線）以及氙燈可作為光源使用。

*1 請(qǐng)務(wù)必注意實(shí)驗(yàn)中的環(huán)境光線。

◆操作方法概要

※以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考。請(qǐng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行探討。

1.　制備含有Controllable NOdonor的培養(yǎng)基

2.　去除培養(yǎng)基

3.　更換含有Controllable NOdonor的培養(yǎng)基^*2

4.　培養(yǎng)30分鐘以上

5.　在任意時(shí)間、部位進(jìn)行光照，然后進(jìn)行各種成像^*3 或生化學(xué)分析

*2 也可不更換培養(yǎng)基，直接添加Controllable NOdonor。

*3 各種成像中使用熒光物質(zhì)作為檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，需要注意熒光物質(zhì)的選擇。詳見下文中的“實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)"。

實(shí)驗(yàn)注意

本產(chǎn)品有可能因?qū)嶒?yàn)環(huán)境的光線（室內(nèi)熒光燈或陽光）分解，釋放出NO。在制備溶液以及進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量保持避光。

◆應(yīng)用實(shí)例

 ■　通過NO電極定量NO釋放活性

作為in vivo NO釋放模型，用黃綠色光（530~590 nm帶通濾波器）照射含10 μM Controllable NOdonor、100 mM HEPES（pH7.3）、0.1% DMSO的溶液，通過NO電極定量釋放的游離NO濃度。連續(xù)300秒照射時(shí)，最大可觀察到4 μM的NO（左）。照射時(shí)間每20秒脈沖一次時(shí)，則可觀察到階段性的NO釋放。隨著試劑消耗，NO的釋放量也逐漸減少（右）。

 ■　使用NO檢測(cè)試劑實(shí)現(xiàn)NO釋放活性可視化

用綠色熒光NO檢測(cè)試劑DAF-FM（10 μM）前處理HEK293T細(xì)胞30分鐘后，用PBS清洗細(xì)胞，在添加Controllable NOdonor的條件下培養(yǎng)30分鐘。使用NO檢測(cè)試劑DAF-FM的熒光強(qiáng)度觀察氙氣光源（帶通濾波器 530~590 nm）照射前后細(xì)胞內(nèi)的NO量。由于光照后DAF-FM的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，可以看出通過光照促使NO釋放。

 ■　通過局部的光照使特定部位釋放NO

用熒光NO檢測(cè)試劑DAF-FM DA（10 μM）前處理HEK293T細(xì)胞30分鐘后，用PBS清洗細(xì)胞，在添加Controllable NOdonor的條件下培養(yǎng)60分鐘。使用共聚焦顯微鏡的543 nm射線光照白圈部分（直徑31 μm），通過DAF-FM檢測(cè)NO的釋放?？梢源_認(rèn)僅白圈部分釋放出NO。使用本試劑，可通過光在時(shí)間空間上控制NO的釋放。

 ■　ex vivo 血管舒張實(shí)驗(yàn)

將分離的大鼠主動(dòng)脈切片浸于填滿Krebs緩沖液的Magnus 試管中，并添加抑制內(nèi)源性NO產(chǎn)生的NO合成酶抑制劑L-NAME（100 μM）。接著，添加去甲xx腺素（10 μM）使血管進(jìn)入收縮狀態(tài)。即使用綠光（530~590 nm）照射3分鐘，也未發(fā)現(xiàn)光自身對(duì)血管收縮有效果（圖中①）。但添加Controllable NOdonor（10 μM）后照射綠光則可觀察到明顯的血管舒張（圖中②④）。停止光照后，再次發(fā)現(xiàn)血管收縮（圖中③⑤）。雖然sGC（soluble guanylyl cyclase）-cGMP路徑參與NO引起的血管舒張，但在該狀態(tài)下添加sGC抑制劑ODQ（10 μM）的話，綠光照射也能抑制血管擴(kuò)張（圖中⑥）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出使用Controllable NOdonor通過光照能夠控制血管舒張。

 ■　評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性

向HEK293T細(xì)胞中分別添加10（推薦濃度）、30、100 μM的Controllable NOdonor并培養(yǎng)48小時(shí)后，使用WST-8分析評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。30 μM以下的細(xì)胞存活率得以維持，但在高濃度的100 μM中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞毒性。本試劑推薦使用10 μM。

◆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

光譜信息

Controllable NOdonor擁有下圖所示的吸收和熒光光譜。530~590 nm的光照可以有效地釋放出NO。另外，由于含有Rosamine骨架，請(qǐng)注意在500~600 nm的光照下激發(fā)，會(huì)觀察到紅色熒光。

熒光染料選擇指導(dǎo)

由于Controllable NOdonor在500~600 nm光照下會(huì)釋放NO，在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)使用熒光物質(zhì)（熒光色素，熒光檢測(cè)試劑，熒光蛋白等）時(shí)，請(qǐng)務(wù)必注意以下幾點(diǎn)。建議提前探討Controllable NOdonor的熒光特性是否會(huì)影響目的熒光物質(zhì)的觀察。

（1）避免使用紅色熒光物質(zhì)

原因如下，在500~600 nm范圍內(nèi)不推薦使用含有激發(fā)波長(zhǎng)的紅色熒光物質(zhì)。

1.　通過激發(fā)光的照射，誘導(dǎo)Controllable NOdonor的NO釋放。

2.　觀察到Controllable NOdonor的Rosamine骨架來源的熒光。

（2）可同時(shí)使用的熒光物質(zhì)

以下波長(zhǎng)范圍的熒光物質(zhì)可以與Controllable NOdonor同時(shí)使用。

激發(fā)波長(zhǎng)<500 nm的熒光物質(zhì)（藍(lán)色熒光物質(zhì)或綠色熒光物質(zhì)等）

激發(fā)波長(zhǎng)>600 nm的近紅外熒光物質(zhì)

※確認(rèn)NO的釋放推薦使用綠色熒光NO檢測(cè)試劑DAF-FM DA

※ 本頁面產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。